基于DNA杂交链式反应的超级三明治结构的构建及应用文献综述

文献综述

杂交链式反应（HCR)

杂交链式反应的基本原理是依据核酸碱基互补配对原则，在引物序列存在时诱发两个自身稳定的核酸发夹探针打开茎环结构，并进行连续的相互杂交。当稳定的发夹DNA探针（H1)遇到可以引发其打开的分子时，便会杂交聚合成一个长的线性直链。而直链中的单个碱基序列就会引发另一个发夹DNA探针（H2）发生杂交，这样就使得先前两个发生杂交的部分序列又会引发H1，随后继续引发H2，如此循环下去^[1]。HCR检测方法基本上有两种，一种是目标DNA作为桥梁不断的与信号探针杂交，使检测信号扩大，另一种是DNA只需结合一条信号探针，另外配合辅助探针和信号探针的作用延伸DNA序列。

超级三明治结构的发展

三明治模型已被广泛应用于DNA、蛋白质、细胞和小分子的识别^[2]。然而，由于每个探针只能捕获一个靶分子，因此该模型的灵敏度较低。为了克服这一缺点，Plaxco及其同事报道了一种新型的超级三明治结构^[3]。他们使信号探针与一个目标DNA的两个区域杂交，形成一个长的DNA多联体，有效地放大信号并提高了灵敏度。相比之下，这种改进的超级三明治结构可以大大地放大检测信号，从而获得更高的灵敏度。

DNA探针放大策略

DNA探针放大策略是将DNA探针固定在工作电极表面以通过杂交识别与其互补的DNA靶标，是构建电化学DNA传感器的关键步骤^[4rsquo;5]。良好的DNA探针固定技术可以提高固定化DNA探针的高反应性和定向性，从而使DNA探针与其互补的DNA靶标杂交^[6]。几种DNA探针固定技术已被应用于电化学DNA传感中，例如吸附法、共价键和亲和素-生物素相互作用。

吸附是DNA探针固定在工作电极表面上最简单的技术，不需要任何化学试剂和DNA探针修饰。 DNA探针通过带正电的膜修饰电极和带负电荷的磷酸基团之间的静电吸附固定在工作电极表面上。已有研究表明，壳聚糖、阳离子聚合物膜使DNA探针的吸附具有良好的生物相容性和高电荷密度^[7，8]。Ribeiro等人将壳聚糖修饰的玻碳电极浸入含有TE缓冲液的DNA探针溶液（3.1 mg / mL-1）中2小时^[9]，当电极表面上存在含有壳聚糖聚合物的游离胺基团（NH ₃）时，它能够与DNA探针上带负电荷的磷酸基团通过静电结合。已被报道表明，如聚赖氨酸（pLL）^[10]、聚吡咯（ppy）^[11]、聚苯胺^[12]等是通过静电吸附来作为固定化策略的DNA基质的。

与吸附技术不同，共价键固定DNA探针技术具有良好的稳定性、柔韧性和高结合强度，可防止DNA探针从电极表面解吸^[13,14]。此外，共价键合技术将DNA探针末端嫁接在电极表面，从而提高了DNA杂交的效率^[15]。在共价键合技术中，合成的DNA探针通常在3′或5′末端与硫醇（SEH）或胺基（NH₂）连接，以共价键合到金属表面或在电极表面引入特定的官能团，这一过程使DNA探针高特异性地吸附着在电极表面，从而防止非特异性结合。

另一种将DNA探针非共价固定在电极表面的方法是将亲和素和生物素形成复合物。这是因为小生物素分子（分子量=2.44.31 g/mol）可以与亲和素/链霉亲和素的结合位点相互作用，并且它们之间的亲和力非常高（K_a=1times;10¹⁵ M），几乎达到共价结合。因此，亲和素/链霉亲和素与生物素分子的结合非常稳定，对极端的温度、酸碱度、变性洗涤剂和有机溶剂具有很强的抵抗力^[6]。此外，亲和素/链霉亲和素可以提供生物素分子的四个结合位点，这些四聚体相互作用可将DNA探针固定在固体电极表面，这可以通过生物素分子修饰DNA探针序列的3′或5′末端，然后将其引入到抗生物素/链霉亲和素修饰的电极中来实现。Gajovic Eichelmann等人^[16]展示了可将链霉亲和素固定在金和碳电极表面的新聚合物莨菪亭（7-羟基-6-甲氧基-香豆素）。